Síntomas persistentes después de COVID | Engranaje Co., Ltd de Shanxi

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 5139 (2023) Citar este artículo

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Entre las incógnitas para decodificar la patogénesis de los síntomas persistentes del SARS-CoV-2 en Long Covid está si existe un papel contribuyente de la inmunidad anormal durante la infección aguda. Se ha propuesto que Long Covid es consecuencia de una respuesta inmune inicial excesiva o inadecuada. Aquí, analizamos la inmunidad humoral y celular del SARS-CoV-2 en 86 trabajadores de la salud con infección por SARS-CoV-2 leve o asintomática confirmada por laboratorio durante la primera ola. Los cuestionarios de síntomas permiten la estratificación entre aquellos con síntomas persistentes y aquellos sin ellos para compararlos. Durante el período de hasta 18 semanas después de la infección, no observamos diferencias en las respuestas de los anticuerpos al pico de RBD o nucleoproteína, la neutralización del virus o las respuestas de las células T. Además, no hay diferencia en el perfil de disminución de anticuerpos. El análisis al año, después de dos dosis de vacuna, que compara a aquellos con síntomas persistentes con aquellos que no los tienen, muestra nuevamente una inmunidad similar al SARS-CoV-2. Por lo tanto, es poco probable que las diferencias cuantitativas en estos parámetros medidos de la inmunidad adaptativa del SARS-CoV-2 después de una infección aguda leve o asintomática hayan contribuido a la causalidad de Long Covid. ClinicalTrials.gov (NCT04318314).

Existe un problema sustancial y continuo planteado por la carga mundial acumulada de morbilidad de quienes padecen síntomas persistentes después de la infección aguda por SARS-CoV-2. Long Covid describe la persistencia de los síntomas más de 4 semanas después de la infección aguda y alrededor de una quinta parte de los casos comprenden aquellos que ahora presentan síntomas después de 2 años1. Varios estudios recientes han tratado de aclarar la variedad de síntomas, las combinaciones en las que ocurren y su progresión a través de lo que a menudo es un curso temporal recurrente y remitente2,3,4. Los estudios identifican más de 200 síntomas asociados, aunque con un conjunto de diagnóstico básico que abarca fatiga/agotamiento, dolor, malestar post-esfuerzo, función cardiovascular, respiratoria, neurológica y cognitiva.

Incluso documentar la carga de morbilidad de la Covid prolongada puede resultar difícil teniendo en cuenta que muchos enfermos no accedieron a pruebas para confirmar el inicio de la infección aguda por SARS-CoV-2 y que no existen pruebas de diagnóstico ni criterios clínicos acordados para definir la afección persistente. La mayoría estima ahora que Long Covid se produce en alrededor del 10% de todas las infecciones, aunque la incidencia puede ser algo menor en un período de infecciones en gran medida irruptivas por subvariantes de Omicron en poblaciones vacunadas5. El Reino Unido, que recopila datos de población relativamente granulares a través de la Oficina de Estadísticas Nacionales (ONS), estima que hay más de 2 millones de casos de Covid prolongado solo en el Reino Unido, y los datos de la Oficina del Censo de EE. UU. estiman más de 16 millones de casos allí1,6. Existen numerosas hipótesis sobre la inmunopatogénesis de Long Covid7. Dentro de una agenda de investigación médica que ha estado fuertemente impulsada por las iniciativas de los propios pacientes8, un área de enfoque ha sido la hipótesis de que la enfermedad puede haber sido desencadenada por anomalías en la respuesta inmune al SARS-CoV-2 durante una infección aguda. Se ha propuesto de diversas formas que los pacientes con Covid prolongado son inusuales porque tienen una inmunidad adaptativa especialmente baja al virus o, alternativamente, que los síntomas persistentes pueden estar relacionados con una respuesta antiviral excesivamente alta e incontrolada. La hipótesis de la "alta respuesta antiviral" es potencialmente compatible con una hipótesis relacionada de etiología de Covid prolongado, a saber, que existe un reservorio crónico de antígeno persistente del SARS-CoV-2, por ejemplo en el intestino9,10. Varios estudios han analizado los fenotipos de los subconjuntos de células T y la inmunidad de las células T al SARS-CoV-2 comparando individuos con o sin Long Covid y han encontrado una serie de diferencias potenciales aunque, hasta el momento, no hay consenso11,12,13,14,15,16 ,17,18. Algunos encuentran evidencia de una inmunidad adaptativa mejorada contra el SARS-CoV-2 en aquellos que progresan a Long Covid: por ejemplo, entre los casos pulmonares de Long Covid en curso, se encontraron respuestas CD4 y CD8 sustancialmente aumentadas12, mientras que otro estudio mostró una respuesta más sostenida de células T y Ab. , aunque en una cohorte más grave, muchos de los cuales habían sido hospitalizados13. Algunos han informado de un aumento de los títulos de anticuerpos convalecientes como marcador de Long Covid. Otros estudios de cohortes no encontraron diferencias entre los grupos en la inmunidad al SARS-CoV-215, o se encontraron respuestas reducidas o en rápido descenso en el Covid prolongado16,17,18.

A lo largo de la pandemia, hemos informado parámetros inmunológicos longitudinales en la cohorte de trabajadores sanitarios (HCW) de BARTS COVIDsortium London, analizados desde marzo de 202019,20,21,22,23,24, e incluyendo análisis proteómicos de biomarcadores de Covid prolongado23. Es decir, se reclutaron 731 trabajadores sanitarios en el biorecurso, incluido un subestudio transversal de casos controlados de 136 trabajadores sanitarios, 76 de los cuales tuvieron infección leve/asintomática por SARS-CoV-2 durante la primera ola, capturada mediante muestreo en serie, con SARS. -Infección por CoV-2 determinada mediante hisopos de ARN nasales basales y semanales, prueba de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) del SARS-CoV-2 de Roche Cobas® y pruebas de anticuerpos (Ab) S1 y N basales y semanales (ver Métodos). Todos los trabajadores sanitarios, independientemente del estado de infección, también informaron datos en un cuestionario de síntomas. Si bien algunos estudios de Long Covid han sido criticados porque reclutan casos "autoinformados" y, a veces, también carecen de poblaciones de control, nuestro estudio ofrece una serie de ventajas: los trabajadores sanitarios tomaron muestras de sangre longitudinales, lo que nos permitió comparar los parámetros inmunológicos en los trabajadores sanitarios con pacientes leves o asintomáticos. Infección por SARS-CoV-2 confirmada por laboratorio durante la primera ola. Además, los cuestionarios del diario de síntomas se iniciaron en un momento en el que no había conocimiento de Long Covid y su perfil de síntomas, lo que hace que este sea un estudio relevante para la persistencia de los síntomas en Long Covid, recopilados en tiempo real en un período de la pandemia en el que los trabajadores sanitarios tenían ningún conocimiento de la condición.

Aquí, mostramos que los parámetros de la respuesta longitudinal de las células Ab y T a los antígenos del SARS-CoV-2 después de una infección leve o asintomática durante la primera ola son indistinguibles entre los trabajadores sanitarios que desarrollaron o no síntomas persistentes.

Al revisar los síntomas persistentes 6 meses después de la infección en marzo de 2020 durante la primera ola, hubo un aumento significativo en la notificación de síntomas persistentes en los trabajadores sanitarios que se habían infectado con SARS-CoV-2 en comparación con los que no. Los primeros tenían más probabilidades de informar dificultad para respirar (8/91, (8,8%) frente a 4/308, (1,3%); p = 0,0084) (Tabla 1). A los 12 meses, el cuestionario se había ampliado para incluir síntomas adicionales. Nuevamente, el grupo previamente infectado tenía más probabilidades de informar una variedad de síntomas persistentes que incluían fatiga (18/86, (20,9%) frente a 9/271, (3,3%); p = 0,0023), dificultad para respirar (10/86, (11,6%) vs 5/271, (1,8%); p = 0,0023), ansiedad (11/86, (12,8%) vs 7/271, (2,6%); p = 0,0046) e insomnio (9/86, (10,5%) vs 5/271, (1,8%); p = 0,0069), siendo la fatiga la más frecuente (Tabla 2).

Por lo tanto, pudimos comparar a los trabajadores sanitarios que habían sufrido COVID-19 leve/asintomático en la primera ola contemporánea, con o sin evidencia de síntomas persistentes, analizando la inmunidad previa a la vacunación con respecto a: Respuesta de unión de Ab al pico (S) y nucleocápside (N) durante y después de la infección aguda, así como neutralizar los títulos de Ab y las respuestas de las células T 4 meses después de la infección (Fig. 1). Esto no solo nos permitió investigar si la persistencia de los síntomas se asociaba con parámetros especialmente altos o bajos para estos elementos de la inmunidad adaptativa del SARS-CoV-2 de forma aguda o en los meses posteriores, sino que también nos permitió utilizar la trayectoria de la respuesta longitudinal de N Ab como una medida indirecta de si era probable que hubiera un reservorio persistente y continuo de antígeno9,10,11. Se podría predecir que la persistencia del antígeno se correlaciona con una respuesta N Ab sostenida o creciente; Desde los primeros principios, un reservorio de antígeno persistente puede ser visible a través de su inmunogenicidad y su impacto en la estimulación continua de la respuesta de Ab al N y, por lo tanto, una tendencia a niveles elevados. Inicialmente consideramos si los grupos que experimentaron o no síntomas persistentes evaluados a los 6 meses diferían en algún aspecto de su respuesta inmune al virus (Fig. 1A-I). Con respecto a la unión de Ab a RBD, no hubo diferencias entre los grupos en términos del título máximo de Ab, y el nivel de Ab se mantuvo de manera similar en ambos grupos hasta la semana 24 (Fig. 1A). Cada grupo contenía una pequeña minoría de trabajadores sanitarios con una respuesta Ab baja o indetectable, como hemos descrito anteriormente24. También fue evidente un patrón similar para la respuesta anti N Ab (Fig. 1B). No encontramos evidencia de inmunidad antiviral aberrante como predictor de síntomas persistentes y los datos tampoco respaldaron firmemente ni una disminución inmune diferencial ni una estimulación inmune continua de un reservorio inmune persistente de virus.

Se realizó un seguimiento semanal de una cohorte de trabajadores de la salud (TS) reclutados en marzo de 2020 con infección por SARS-CoV-2 confirmada por laboratorio (n = 86, 33 % hombres). Se analizó el suero para determinar los títulos de anticuerpos de la nucleocápsida A S1 RBD y B. Veinticinco trabajadores sanitarios informaron síntomas persistentes 12 meses después de la infección (círculo abierto, 28 % hombres), mientras que los 61 trabajadores sanitarios restantes se recuperaron por completo (círculo cerrado, 34 % hombres). En ambos paneles, se representan gráficamente el título máximo de anticuerpos durante el seguimiento de 24 semanas y los datos longitudinales para cada trabajador sanitario. Los títulos de anticuerpos de nucleocápside y RBD de C S1 se trazaron longitudinalmente en relación con el momento de la PCR de SARS-CoV-2 positiva (recuperados, negro, n = 15, 40 % hombres; síntomas persistentes, rojo, n = 9, 44 % hombres). Treinta y siete de los trabajadores sanitarios recuperados (círculo cerrado, 30% hombres) y 21 de los trabajadores sanitarios con síntomas persistentes (círculo abierto, 24% hombres) fueron analizados para detectar anticuerpos neutralizantes D (IC50) contra el SARS-CoV-2 ancestral (Wuhan Hu- 1) cepa de pseudovirus entre las 16 y 18 semanas; Respuesta de las células ET contra proteínas recombinantes de espiga y nucleocápside y grupos de péptidos F que contienen epítopos mapeados de proteínas de espiga, nucleocápside, membrana y ORF3a/7a. Respuesta de las células GT contra un conjunto de péptidos que contienen epítopos de citomegalovirus, virus de Epstein Barr e influenza (recuperados, n = 34, círculo cerrado, 29 % hombres; síntomas persistentes, n = 19, círculo abierto, 26 % hombres). Para A–G, el número de trabajadores sanitarios que muestran una respuesta positiva para cada ensayo se muestra en la parte superior de cada gráfico y la proporción de cada grupo con una respuesta alta (negro), baja (gris) o ninguna respuesta (blanco) se representa mediante un anillo. parcelas a continuación. Respuestas longitudinales de las células T a megapools de péptidos con pico H y sin pico I analizados por ELISpot (en trabajadores sanitarios recuperados, círculo negro, n = 14, 36 % hombres; y trabajadores sanitarios que informan síntomas persistentes, círculo rojo, n = 8, 50 % hombres) a los 12 meses después de la infección por SARS-CoV-2. Los datos se representan en relación con el momento en que el personal sanitario tuvo una PCR positiva para SARS-CoV-2. Se utilizaron pruebas U de Mann-Whitney de dos colas (Graphpad Prism versión 8.0) para detectar diferencias significativas entre los trabajadores sanitarios recuperados y los que informaron síntomas persistentes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Las barras de error que se muestran son la media geométrica ± 1 DE geométrica. Anticuerpo Ab, índice de corte COI, nucleocápside N, marco de lectura abierto ORF, células mononucleares de sangre periférica PBMC, dominio de unión al receptor RBD, desviación estándar SD, células formadoras de manchas SFC, unidades U.

Además, no observamos diferencias significativas entre estos grupos cuando se analizaron entre 16 y 18 semanas después de la infección aguda para determinar la neutralización de Ab IC50 contra el pseudovirus de pico ancestral (Fig. 1D). Se utilizó ELISpot para buscar diferencias entre la frecuencia de respuesta de las células T específicas para cualquiera de: proteína de pico, proteína N (Fig. 1E), conjunto de epítopos mapeados de pico (MEP)19,20,21,24,25, N MEP, M MEP, o MEP ORF3a/7a (Fig. 1F). La frecuencia media de células respondedoras a cada antígeno fue similar entre los grupos, al igual que la frecuencia absoluta de los individuos que respondieron. Cada grupo contenía una pequeña minoría de individuos que no presentaban una respuesta de células T detectable después de la infección, como hemos descrito anteriormente24. Se ha propuesto que la reactivación del EBV puede ser un factor subyacente en Long Covid, por lo que aquí incluimos datos de células T de la respuesta en cada grupo al conjunto de péptidos CEF, lo que nos permite utilizar respuestas dentro del conjunto a epítopos HLAI comunes dentro del EBV. productos genéticos tempranos inmediatos BMLF, BRLF y BZLF, así como EBNA3 como indicador del reconocimiento de células T del EBV reactivado. No se observaron diferencias entre los grupos persistente y de recuperación, aunque con la advertencia de que estas respuestas también abarcan epítopos de CMV e influenza (Fig. 1G). Luego exploramos las respuestas longitudinales de las células T en trabajadores sanitarios con infección confirmada por PCR, que posteriormente informaron o no síntomas persistentes y para quienes había muestras semanales de PBMC disponibles. Para estar seguros de que no habíamos pasado por alto las diferencias en la respuesta de las células T relacionadas con epítopos seleccionados dentro del proteoma viral, estos estudios utilizaron megagrupos completos de epítopos del SARS-CoV-2 que abarcan péptidos con o sin pico (Fig. 1H, I; Suplementario). Figura 1)26. Nuevamente, no se pudo observar ningún patrón diferencial de respuesta entre los trabajadores sanitarios con o sin síntomas persistentes. Por lo tanto, no encontramos evidencia de una respuesta diferencial de anticuerpos neutralizantes o de una respuesta diferencial de células T a cualquiera de las regiones analizadas del proteoma viral del SARS-CoV-2 entre el grupo que se recuperaría por completo y el que experimentaría síntomas persistentes. .

Reevaluamos la cohorte de trabajadores sanitarios 12 meses después de la primera ola de infecciones agudas, analizando ahora un cuestionario de síntomas más detallado y parámetros inmunológicos en este momento posterior, después de dos dosis de la vacuna Pfizer. La fatiga siguió siendo el síntoma persistente más común (Tabla 2). No identificamos diferencias en la respuesta de inmunidad híbrida Ab a S1 RBD o N en aquellos con síntomas persistentes en comparación con aquellos que se habían recuperado por completo (Fig. 2A, B). Este fue también el caso de la neutralización de Ab IC50 y las respuestas de las células T a S y N MEP. (Fig. 2C, D; Fig. complementaria 2).

A S1 RBD (recuperado, círculo cerrado, n = 53, 40% hombres); Síntomas persistentes, círculo abierto, n = 25, 28% hombres) y títulos de anticuerpos de la nucleocápsida B (recuperados, círculo cerrado, n = 61, 34% hombres; Síntomas persistentes, círculo abierto, n = 25, 28% hombres) en trabajadores sanitarios 12 meses después de que el laboratorio confirmara la infección por SARS-CoV-2. Los datos de S1 RBD se representan para los trabajadores sanitarios que habían recibido 2 dosis de la vacuna COVID-19 en el momento de la muestra de sangre de 12 meses. El número de trabajadores sanitarios con un título de anticuerpos positivo se muestra en la parte superior de cada gráfico. La proporción de trabajadores sanitarios con un título alto (negro), bajo (gris) o sin títulos de anticuerpos (blanco) se muestra en los gráficos de anillos a continuación. Quince trabajadores sanitarios recuperados (círculo cerrado, 57 % hombres) y 7 trabajadores sanitarios con síntomas persistentes (círculo abierto, 57 % hombres) fueron analizados para determinar el anticuerpo neutralizante C IC50 contra el virus SARS-CoV-2 ancestral vivo (Wuhan Hu-1) y las células DT. respuestas contra grupos de péptidos de epítopos mapeados de picos y nucleocápside, 12 meses después de que el laboratorio confirmara la infección por SARS-CoV-2. En la parte superior de cada gráfico se muestra el número de trabajadores sanitarios que muestran una respuesta positiva de anticuerpos neutralizantes o células T para cada ensayo. La proporción de trabajadores sanitarios en cada grupo con una respuesta alta (negro), baja (gris) o ninguna respuesta (blanco) (como se define en cada clave) se representa mediante gráficos de anillos a continuación. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney de dos colas (Graphpad Prism versión 8.0) para detectar diferencias significativas entre los trabajadores sanitarios recuperados y los que informaron síntomas persistentes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Los trabajadores sanitarios con evidencia serológica de una reinfección posterior por SARS-CoV-2 entre 6 y 12 meses están anotados en verde. Los trabajadores sanitarios que informaron dificultad para respirar persistente a los 12 meses se muestran como círculos abiertos de color púrpura. Las barras de error que se muestran son la media geométrica + 1 DE geométrica. Anticuerpo Ab, índice de corte COI, trabajadores sanitarios, nucleocápside N, células mononucleares de sangre periférica PBMC, dominio de unión al receptor RBD, desviación estándar SD, células formadoras de manchas SFC, unidades U.

Una limitación de este estudio es que la clasificación de las infecciones por COVID-19 de la primera ola que fueron "recuperadas" o "síntomas persistentes" utilizó diarios de síntomas anteriores a una comprensión más completa de Long Covid y sus síntomas definitorios4. En algunos aspectos, también es un punto fuerte de nuestro estudio haber trabajado con una cohorte de trabajadores sanitarios que informaron su infección en un momento en el que aún no se reconocía Long Covid. En comparación con cohortes posteriores personalizadas diseñadas para estudiar Long Covid, nuestro conjunto de datos está limitado por la baja cantidad de personas en nuestra cohorte de trabajadores sanitarios con síntomas persistentes. Sin embargo, la conclusión de esta comparación es que el desarrollo de síntomas persistentes no se correlaciona explícitamente con una respuesta diferencial de células T o Ab a la infección viral aguda. Es decir, no hay indicios de una anomalía manifiesta en el manejo de la infección viral inicial. Además, es una condición sine qua non para otras infecciones persistentes o latentes, como el VEB, que la fase persistente se evidencie por un título de Ab persistente o creciente para un subconjunto de antígenos27. Observamos que algunos datos publicados sobre cohortes de Long Covid difirieron de nuestros hallazgos en la identificación de cambios en la inmunidad adaptativa del SARS-CoV-2, pero son distintos de nuestro estudio en la medida en que se trata de estudios centrados en infecciones agudas más graves o que se centraron en infecciones agudas más graves. analizado en momentos mucho más posteriores11,12,13,14,15,16,17,18. El hecho de que no hayamos visto una respuesta diferencial de Ab en el grupo de síntomas persistentes de esta cohorte podría considerarse un argumento en contra de la hipótesis del "reservorio de antígeno persistente" como comúnmente causal en Long Covid.

Esta investigación cumple con todas las normas éticas pertinentes. El recurso biológico COVIDsortium Healthcare Workers fue aprobado por el comité de ética del Servicio Nacional de Ética en Investigación del Reino Unido (20/SC/0149) y registrado en ClinicalTrials.gov (NCT04318314). El estudio se ajusta a los principios de la Declaración de Helsinki y todos los sujetos dan su consentimiento informado y por escrito. El esquema del estudio principal y las características iniciales de la cohorte longitudinal prospectiva de trabajadores sanitarios establecida para estudiar la protección inmune y la patogénesis en COVID-19 están disponibles en Wellcome Open Res 2020, 5:179 https://doi.org/10.12688/wellcomeopenres.16051.1.

La cohorte de trabajadores sanitarios (HCW) de COVIDsortium y los detalles del seguimiento y análisis posteriores se han descrito en detalle en otro lugar24. En resumen, se invitó a los trabajadores sanitarios adultos (definidos como >18 años) a participar a través de publicidad local (ver https://covid-consortium.com). Inicialmente se reclutó una cohorte (n = 400) del St Bartholomew's Hospital, Londres, en la semana del 23 al 31 de marzo de 2020. Luego, el reclutamiento se amplió (del 27 de abril al 7 de mayo de 2020) para incluir 331 participantes adicionales de: St Bartholomew's Hospital (n = 101), NHS Nightingale Hospital (n = 10) y Royal Free Hospital, Londres (n = 220), lo que suma 731 trabajadores sanitarios en total (Figura complementaria 3).

Se utilizó un diseño de cohorte longitudinal, observacional y prospectivo que incluía cuestionarios que recopilaban datos sobre información demográfica, síntomas y riesgo de exposición. Las muestras se recolectaron al inicio y en las visitas de seguimiento semanales durante 15 semanas y a los 4, 6 y 12 meses. En las visitas de seguimiento semanales, la información sobre la carga de síntomas se registró utilizando un cuestionario estandarizado que registra los síntomas clasificados como "definición de caso" (fiebre, nueva tos seca continua o nueva pérdida del gusto o del olfato), "sin definición de caso" ( síntomas distintos de los síntomas que definen el caso) o ningún síntoma reportado. Cuando el personal sanitario regresó del autoaislamiento sintomático, se recogieron muestras de convalecientes. La infección por SARS-CoV-2 confirmada por laboratorio durante la primera ola se identificó mediante RT-PCR basal y semanal utilizando la prueba Roche Cobas® SARS-CoV-2 y el ensayo IgG Ab para aumentar el antígeno de la proteína S1 (Euroimmun Anti-SARS-CoV- 2 ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas [ELISA] #EI2606-9601G); y ensayo de anticuerpos totales antinucleocápside (inmunoensayo de electroquimioluminiscencia anti-SARS-CoV-2 de Roche Elecsys [ECLIA] n.º 09203079190). Las proporciones de Ab > 1,1 se consideraron positivas para el ELISA Euroimmun SARS-CoV-2 y > 1 se consideraron positivas para el ECLIA anti-SARS-CoV-2 de Roche Elecsys. Un total de 157 (21,5%) trabajadores sanitarios tenían infección por SARS-CoV-2 confirmada por laboratorio, de los cuales 49 (31%) eran asintomáticos. Las infecciones fueron asintomáticas o leves. La cohorte de trabajadores sanitarios es, por lo tanto, una cohorte de COVID-19 longitudinal en edad laboral, comunitaria en lugar de hospitalizada, con infección aproximadamente sincrónica durante la primera ola que alcanzó su punto máximo alrededor del 23 de marzo de 2020.

A los 12 meses de seguimiento, se pidió a los trabajadores sanitarios que completaran un cuestionario de síntomas que permitiera una evaluación posterior de la persistencia de los síntomas. Se utilizaron títulos de anticuerpos antinucleocápside para definir a los participantes del personal sanitario como sin infección previa (n = 271) o con antecedentes de infección previa por SARS-CoV-2 (n = 86). Los datos del cuestionario se utilizaron para establecer si los trabajadores sanitarios que tenían antecedentes de infección por SARS-CoV-2 durante la primera ola se habían recuperado (n = 61) o tenían síntomas persistentes (n = 25). Las características demográficas y de síntomas de cada uno de estos tres grupos se muestran en la Tabla 2.

Las pruebas de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 se llevaron a cabo en la Agencia de Seguridad Sanitaria del Reino Unido, en Porton Down: las pruebas de detección de anticuerpos anti-nucleocápside y anti-pico se realizaron utilizando el analizador Roche cobas® e801. Los anticuerpos antinucleocápside se detectaron utilizando el ensayo de nucleocápside cualitativo del analizador inmunológico por electroquimioluminiscencia (ECLIA) anti-SARS-CoV-2 de Roche Elecsys® (Roche ACOV2, n.° 09203079190). Los anticuerpos anti-RBD se detectaron mediante el ensayo cuantitativo de picos ECLIA anti-SARS-CoV-2 de Roche Elecsys® (Roche ACOV2S, n.º 09289275190). Los ensayos se realizaron y calibraron según lo recomendado por el fabricante. Los resultados de la antinucleocápside se expresan como un valor de índice de corte (COI) basado en la señal de electroquimioluminiscencia de una calibración de dos puntos, con resultados COI ≥ 1,0 clasificados como positivos. Los resultados de Anti-S1 RBD se expresan en unidades por ml (U/ml) de manera similar en base a una calibración de dos puntos y una curva maestra específica del reactivo, con un rango cuantitativo de 0,4 a 2500 U/ml. Las muestras con un valor ≥1,0 U/ml se interpretan como positivas para anticuerpos contra picos.

Los ensayos de neutralización del pseudotipo de SARS-CoV-2 se realizaron utilizando partículas lentivirales pseudotipadas preparadas mediante cotransfección con polietilenimina lineal 25 K (Polysciences #23966) de HEK-293T (ATCC, #CRL-3216) con plásmido de expresión de pcDNA de pico de SARS-CoV-2. , el plásmido gag-pol p8.91 del VIH y la luciferasa de luciérnaga que expresan el plásmido pCSFLW en una proporción de 1:1:1,5. Los ensayos de TCID se realizaron mediante transducción de células Huh7 (ECACC, n.º 01042712) para calcular el título viral y la dosis infecciosa para ensayos de neutralización posteriores.

Para realizar ensayos de neutralización de virus pseudotipo, el suero de los participantes del estudio se inactivó por calor a 56 °C durante 30 minutos para eliminar la actividad del complemento. El suero se diluyó en DMEM y se realizó una serie de diluciones dobles de 100 µl de 7 puntos por duplicado en placas blancas de 96 pocillos de fondo plano (ThermoFisher, n.° 136101) con una dilución inicial de 1:20. En total, se agregaron a cada pocillo 1 × 105 unidades de luz relativas (RLU) de partículas lentivirales pseudotipadas de SARS-CoV-2 y se incubaron a 37 °C durante 1 h. Ocho pocillos de control por placa recibieron pseudotipo y células únicamente (control de virus) y 8 pocillos recibieron únicamente células (control de fondo). Se espaciaron en todas las placas controles negativos de sueros prepandémicos combinados, recolectados antes de 2008, y un neutralizador positivo. Las URL de cada pocillo se estandarizaron frente a controles técnicos positivos (control de virus) y negativos (solo células) en cada placa para determinar el porcentaje de neutralización. En total, se agregaron/pocillo 4 x 104 células Huh7 suspendidas en 100 μl de medio y se incubaron durante 72 h a 37 °C y 5% de CO2. La luminiscencia de la luciferasa de luciérnaga se midió utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Steady-Glo® (Promega #E2510) y un lector de placas CLARIOStar (BMG Labtech). Se calculó la neutralización promedio de duplicados para cada dilución de suero. Se trazaron curvas de neutralización para cada muestra de suero y el porcentaje de neutralización se modeló como una función logística del factor de dilución del suero (log10).

Ensayos de microneutralización de virus vivos de cepa ancestral SARS-CoV-2

El aislado del virus SARS-CoV-2 cepa 2019‐nCoV/BavPat1/2020 (Wuhan Hu-1) se obtuvo del European Virus Archive Global (EVAg, Charité Universitätsmedizin Berlin, Alemania). Las reservas de virus se prepararon mediante la inoculación de matraces de cultivo celular de 75 cm2 sembrados con VeroE6 con sobrenadante de cultivo celular de virus que contenía 2,2 x 106 unidades formadoras de placa (UFP) en un volumen de 10 ml de DMEM que contenía FBS al 10 %. El medio de cultivo que contenía virus se recogió cuando >80% de las células mostraron efecto citopático (CPE).

Los títulos de las reservas virales se determinaron desafiando monocapas de células VeroE6 (ATCC, #VERO C1008) con diluciones en serie de virus y cultivando durante 20 h antes de la tinción intracelular in situ para identificar focos de infección. La tinción se realizó fijando las células con metanol:acetona enfriado con hielo (50:50) e incubando con sueros de convalecientes (dilución 1:2000) en PBS con FBS al 1% durante 1 h a 37 °C. Después de 3 lavados con PBS, las células se incubaron con un anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con β-galactosidasa (dilución 1:400, policlonal, Southern Biotech #2040-06) durante 1 hora más a 37 °C. Las células se lavaron 3 veces más con PBS antes de la incubación con 300 µl de 0,5 mg/ml de sustrato cromogénico de 5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-galactopiranósido (X-gal, Bioline, n.° BIO-37035) en PBS que contenía Ferricianuro de potasio 3 mM y cloruro de magnesio 1 mM a 37 ° C durante hasta 4 h. Las células infectadas se tiñeron de azul y se contaron como focos de infección para determinar el título del virus expresado como unidades formadoras de focos (FFU) por ml.

Para realizar ensayos de neutralización de virus vivos, se sembraron células VeroE6 en placas de 96 pocillos 24 h antes de la infección. Las valoraciones (serie de diluciones de 7 puntos y 2 veces) de los sueros de los participantes inactivados por calor se realizaron por duplicado, comenzando con una dilución de 1:20 y se incubaron con 3 × 104 FFU del virus SARS-CoV-2 (TCID100) a 37 °C. durante 1 h. Se agregaron preparaciones de suero/virus a las células y se incubaron durante 72 h. Las células supervivientes se fijaron en formaldehído y se tiñeron con una solución de cristal violeta al 0,1% (p/v) y se resolubilizaron en una solución de dodecilsulfato de sodio al 1% (p/v). Las lecturas de absorbancia se tomaron a 570 nm utilizando un CLARIOStar PlateReader (BMG Labtech). Los controles negativos de sueros prepandémicos combinados (recolectados antes de 2008) y el suero combinado de individuos convalecientes de SARS-CoV-2 con neutralización positiva se espaciaron a lo largo de las placas. La absorbancia de cada pocillo se estandarizó frente a controles técnicos positivos (control de virus) y negativos (solo células) en cada placa para determinar los valores de porcentaje de neutralización. Los valores de CI50 se determinaron a partir de curvas de neutralización. Todos los ensayos auténticos de propagación y microneutralización del SARS-CoV-2 se realizaron en una instalación de nivel 3 de contención.

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de muestras de sangre heparinizadas utilizando centrifugación en gradiente de densidad Pancoll (Pan Biotech #P04-60500) o Histopaque®-1077 Hybri-MaxTM (Sigma-Aldrich #H8889) en tubos SepMateTM (Stemcell #85450). Se sintetizaron trece péptidos de 20 unidades basados en las secuencias de proteínas del SARS-CoV-2 S1 (spike), nucleocápside (N), membrana (M) o marcos de lectura abiertos 3a y 7a (ORF3a/7a) descritos anteriormente (GL Biochem Shanghai Ltd. , China)24,25. Las proteínas recombinantes de pico y nucleocápside del SARS-CoV-2 S1 se obtuvieron del Centro de Reactivos para el SIDA (CFAR), del Instituto Nacional de Estándares y Control Biológicos (NIBSC), Reino Unido, y del Dr. Peter Cherepanov, del Instituto Francis Crick, Reino Unido. Para estimular PBMC, proteínas recombinantes, grupos separados de secuencias para Spike (18 péptidos), N (10 péptidos), M (6 péptidos) y ORF3a/7a (7 péptidos)24,25, o un megagrupo de péptidos que cubra toda la secuencia. de pico (127 péptidos cada uno de 20 aa de largo y superpuestos por 10 aa) y un megagrupo de péptidos sin pico (284 péptidos)26. Las PBMC de ensayo se cultivaron en medio RPMI (Gibco n.° 11875093) suplementado con FBS al 10 %, 1 x solución de penicilina y estreptomicina (Gibco n.° 15140122) y L-glutamina 2 mM (Gibco n.° A2916801) (R10). Se lavaron placas ELISpot prerecubiertas (Mabtech #3420-2APT) x4 con PBS estéril y se bloquearon con R10 durante 1 hora a temperatura ambiente. Se utilizaron 200.000 PBMC por pocillo y se estimularon durante 20 h con proteínas recombinantes del SARS-CoV-2 (10 µg/ml), grupos de epítopos mapeados (10 µg/ml/péptido) o megagrupos (2 µg/ml/péptido). Los controles internos de la placa fueron R10 solo (sin células) y anti-CD3 (dilución 1:1000, clon CD3-2, Mabtech, nº 3605-1-50). Las placas se desarrollaron con Ab de detección de IFNγ biotinilado humano, conjugado directamente con fosfatasa alcalina (clon 7-B6-1-ALP, Mabtech, #3420-9 A), diluido 1:200 en PBS con FBS al 0,5%, incubando 100 µl/pocillo. durante 2 h, seguido de 100 μl/pocillo de sustrato de fosfatasa BCIP/NBT-plus filtrado estéril (Mabtech #3420-2APT) durante 5 min. Las placas se lavaron, secaron y leyeron en un lector de placas AID-ELISpot. El análisis de los datos de ELISpot se realizó en Microsoft Excel. El promedio de dos pocillos R10 se restó de todos los pocillos estimulados con péptidos y cualquier respuesta que fuera inferior a 2 DE de los pocillos de control específicos de la muestra no se consideró específica de péptido. Los resultados se expresaron como diferencia en células formadoras de manchas (delta)/106 PBMC entre el control negativo y la estimulación peptídica. Los resultados se excluyeron si los pocillos de control negativo tenían >100 SFU/106 PBMC o si los pocillos de control positivo eran negativos. Los resultados se trazaron utilizando Prism v8.0 para Mac OS (GraphPad).

Las diferencias estadísticamente significativas en la frecuencia de los síntomas entre los trabajadores sanitarios sin infección previa y los infectados por SARS-CoV-2 se analizaron mediante las pruebas exacta de Fisher corregida por Bonferroni (Tabla 1) o Chi cuadrado (Tabla 2). Las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de síntomas recuperados y persistentes para los datos de células T y anticuerpos se probaron mediante la prueba U de Mann-Whitney de dos colas (Figs. 1, 2, Figura 2 complementaria), ya que se supuso que los datos tenían una distribución no gaussiana y, por lo tanto, Se utilizaron pruebas no paramétricas de dos colas. Se consideró significativo un valor de p <0,05. Para el análisis se utilizó Prism v. 8.0 para Mac.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos necesarios para evaluar las conclusiones de este artículo se presentan en el artículo o en el Material complementario. Los datos de origen se proporcionan con este documento en el archivo de datos de origen. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Los autores agradecen a los participantes de los trabajadores sanitarios por participar en el estudio y a los equipos de investigación involucrados en el reclutamiento, la obtención del consentimiento y el muestreo de los participantes de los trabajadores sanitarios. El recurso biológico COVIDsortium Healthcare Workers está aprobado por el comité de ética del Servicio Nacional de Ética en Investigación del Reino Unido (20/SC/0149) y registrado en ClinicalTrials.gov (NCT04318314). El estudio se ajusta a los principios de la Declaración de Helsinki y todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito. Nigel Temperton suministró el lentivirus pseudotipado de la cepa ancestral del SARS-CoV-2. Esta obra está bajo una licencia Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0), que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que la obra original esté debidamente citada. Para ver una copia de esta licencia, visite https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Esta licencia no se aplica a figuras/fotos/obras de arte u otro contenido incluido en el artículo que se atribuye a un tercero; obtener autorización del titular de los derechos antes de utilizar dicho material. RJB y DMA cuentan con el respaldo de MRC (MR/S019553/1, MR/R02622X/1, MR/V036939/1, MR/W020610/1), NIHR Imperial Biomedical Research Center (BRC): ITMAT, Cystic Fibrosis Trust SRC (2019SRC015 ), NIHR EME Fast Track (NIHR134607), NIHR Long Covid (COV-LT2-0027), Innovate UK (SBRI 10008614) y Horizon 2020 Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (ITN) European Training Network (n.º 860325). ÁM cuenta con el apoyo de MRC (MR/W020610/1), NIHR EME Fast Track (NIHR134607), Rosetrees Trust, The John Black Charitable Foundation y Medical College of St Bartholomew's Hospital Trust. El COVIDsortium cuenta con el respaldo de fondos donados por individuos, fideicomisos benéficos y corporaciones, incluidos Goldman Sachs, Kenneth C Griffin, The Guy Foundation, GW Pharmaceuticals, Kusuma Trust y Jagclif Charitable Trust, y está habilitado por Barts Charity con el apoyo de UCLH Charity. Se reconoce un apoyo más amplio en el sitio web de COVIDsortium. El apoyo institucional de Barts Health NHS Trust y Royal Free NHS Foundation Trust facilitó los procesos de estudio, en asociación con University College London y Queen Mary University of London. MKM cuenta con el apoyo de UKRI/NIHR UK-CIC, Wellcome Trust Investigator Award (214191/Z/18/Z) y la subvención CRUK Immunology (26603). JCM, CM y TAT cuentan con el apoyo directo e indirecto de los hospitales University College London (UCLH) y los centros de investigación biomédica Barts NIHR y a través del premio Accelerator Award de la British Heart Foundation (BHF) (AA/18/6/34223). TT está financiado por una beca de investigación intermedia de BHF (FS/19/35/34374). MN cuenta con el apoyo de Wellcome Trust (207511/Z/17/Z) y de NIHR Biomedical Research Funding para UCL y UCLH. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación de datos, el análisis de los datos, la interpretación de los datos o la redacción del informe.

Al final del artículo aparece una lista de autores y sus afiliaciones.

Departamento de Inmunología e Inflamación, Imperial College London, Londres, Reino Unido

Daniel Altmann

Departamento de Enfermedades Infecciosas, Imperial College London, Londres, Reino Unido

Catherine J. Reynolds y Rosemary J. Boyton

St Bartholomew's Hospital, Barts Health NHS Trust, Londres, Reino Unido

George Joy, Charlotte Manisty, Thomas A. Treibel y James C. Moon

Instituto de Ciencias Cardiovasculares, University College London, Londres, Reino Unido

George Joy, Charlotte Manisty, Thomas A. Treibel y James C. Moon

Agencia de Seguridad Sanitaria del Reino Unido, Porton Down, Reino Unido

Ashley D. Nutria, Tim Brooks y Amanda Semper

Blizard Institute, Barts y la Escuela de Medicina y Odontología de Londres, Universidad Queen Mary de Londres, Londres, Reino Unido

Joseph M. Gibbons, Corinna Pade y Áine McKnight

División de Infección e Inmunidad, University College London, Londres, Reino Unido

Leo Swadling, Mala K. Maini y Mahdad Noursadeghi

División de Pulmones, Hospitales Royal Brompton y Harefield, Guy's and St Thomas' NHS Foundation Trust, Londres, Reino Unido

Romero J. Boyton

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RJB y D.MA. conceptualizó y diseñó el estudio reportado. RJB y DMA diseñaron y supervisaron los experimentos con células T. SOY. diseñó y supervisó los experimentos nAb. TB y A.Se supervisaron estudios completos de picos y S1 RBD IgG y N IgG/IgM. CJR desarrolló, realizó y analizó experimentos con células T. LS realizó el experimento de células T utilizando el conjunto de péptidos CEF supervisado por MKMJMG y CP desarrolló, realizó y analizó experimentos de nAb. ADO realizó y analizó ensayos de anticuerpos de pico, RBD y N. TB, CM, Á.M., TAT, JCM y MN establecieron la cohorte COVIDsortium HCW. CJR, DMA y RJB analizaron los datos. CJR, GJ, JMG, CP, ADO, CM, TAT, JCM, MKM, A.Se., TB, MN, Á.M., DMA y RJB interpretaron los datos. RJB y DMA escribieron el manuscrito con aportaciones de los autores. Todos los autores revisaron y editaron el manuscrito y las figuras.

Correspondencia a Daniel M. Altmann o Rosemary J. Boyton.

RJB y DMA son miembros del Consorcio Global de Expertos en células T y han realizado consultas para Oxford Immunotec fuera del trabajo presentado. DMA ha recibido pagos de honorarios de Pfizer, AstraZeneca y Novavax por trabajos de consultoría. Los demás autores no declaran tener intereses en conflicto.

Nature Communications agradece a Adam Waickman y a otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Altmann, DM, Reynolds, CJ, Joy, G. et al. Los síntomas persistentes después de COVID-19 no están asociados con la inmunidad diferencial de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 o de las células T. Nat Comuna 14, 5139 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40460-1

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Recibido: 30 de noviembre de 2022

Aceptado: 27 de julio de 2023

Publicado: 23 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40460-1

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